Desenvolvimento de anticorpos monoclonais terapêuticos para uso no tratamento de leucemia – Estágio no Centro Infantil Boldrini
Ciências Básicas
INTRODUÇÃO
1. Programa de Educação em Oncologia Pediátrica (PEOp).
O Programa de Educação em Oncologia Pediátrica (PEOp) do Centro Infantil Boldrini proporciona a experiência de treinamento em laboratórios de Hematologia, Biologia Molecular, Genética, Imunoengenharia, Serviço de Imagem, Epidemiologia, Saúde Mental, e Odontologia para estudantes de graduação das áreas de saúde e biológicas. O objetivo primário do programa é encorajar os estudantes à pesquisa em oncologia pediátrica, com base em laboratório ou em clínica.
O curso é ministrado em tempo integral (carga horária total de 240 horas), no período de férias. A inserção dos alunos em atividades práticas faz-se indiretamente, através de discussões semanais de casos pré-programados, estimulando-os na pluralidade do raciocínio clínico, sob tutorado docente. Adicionalmente, o curso possibilita o desenvolvimento da autonomia do estudante, por meio da elaboração de anteprojeto de pesquisa de iniciação científica, aplicado à realidade da saúde, a ser proposto e realizado ulteriormente. Como alternativa, o estudante pode optar pela produção de ensaio de revisão bibliográfica, sobre tema pertinente ao seu treinamento.
2. Desenvolvimento de anticorpos monoclonais terapêuticos.
Anticorpos são imunoglobulinas do sistema imune, produzidas por linfócitos B diferenciados, os plasmócitos. São capazes de reconhecer moléculas ou patógenos específicos, chamados antígenos. Anticorpos monoclonais (AcM) são anticorpos idênticos produzidos a partir de um mesmo clone de linfócito B. Estes AcM podem ser úteis em testes diagnósticos, em usos analíticos e químicos, e em tratamentos terapêuticos. De fato, os AcM estão entre os principais biofármacos utilizados no tratamento de algumas doenças, como câncer e doenças autoimunes. Suas vantagens em relação às drogas convencionais incluem boa solubilidade e estabilidade, alta especificidade, baixo risco de bioconversão em metabólitos tóxicos, habilidade de ativar o sistema imune próprio do paciente, e grande capacidade de modificações bioquímicas.
A maneira clássica mais utilizada para geração de anticorpos monoclonais é a técnica de hibridomas, criada por César Milstein e George J. F. Köhler em 1975. Nesta técnica, há cinco estágios básicos: (1) imunização animal, (2) fusão e seleção, (3) screening, (4) caracterização, e (5) desenvolvimentos adicionais.
A imunização (1) é a ativação do sistema imune de um animal, através da injeção de um antígeno, contra o qual se deseja produzir anticorpos. Em geral, proteínas, células ou peptídeos sintéticos são usados para a imunização de camundongos Balb/c. Quando o nível de anticorpos no soro do animal é elevado, remove-se as células B do baço (esplenócitos) para a produção dos hibridomas.
A fusão e seleção (2), consiste na fusão de esplenócitos murinos com células de mieloma histocompatíveis, formando os hibridomas, e seleção destes. A fusão ocorre com auxílio de um agente fusionante, o polietileno glicol (PEG). Estas células são cultivadas em um meio seletivo HAT, onde apenas as células fusionadas (mieloma/esplenócitos) sobrevivem.
O screening (3) consiste na identificação e seleção dos hibridomas produtores de anticorpo que reconhece o antígeno de interesse. Para isso, utilizam-se formas ortogonais de identificá-los, através de técnicas como ELISA, citometria de fluxo e Western blot. É importante a confirmação ortogonal dos resultados, pois os anticorpos podem reagir melhor em um determinado sistema devido ao estado do epítopo de ligação em uma determinada técnica.
A caracterização (4) dos anticorpos monoclonais em termos de reatividade, especificidade e reatividade cruzada é realizada através de determinação do isotipo do anticorpo, mensuração da afinidade anticorpo-antígeno e realização de diferentes sistemas de ensaios funcionais in vitro e in vivo.
Por fim, desenvolvimentos adicionais (5) podem ser realizados uma vez que os anticorpos monoclonais podem servir como ferramentas de pesquisa para ensaios diagnósticos ou como agentes terapêuticos. Anticorpos monoclonais murinos efetivos para o tratamento de pacientes podem induzir a produção de anticorpos humanos anti-murinos (HAMA). Esse problema tem sido contornado pela quebra da região imunogênica Fc do anticorpo ou por metodologias recombinantes, produzindo anticorpos quiméricos contendo a unidade de reconhecimento murina e a região Fc humana. Outras modificações também são possíveis, como a conjugação com radionuclídeos ou toxinas.
OBJETIVO
O presente Relato de Experiência tem como objetivos divulgar o Programa de Educação em Oncologia Pediátrica (PEOp) do Centro Infantil Boldrini e divulgar parte das atividades realizadas no Centro de Pesquisa Boldrini. Assim, permite-se que estudantes da graduação conheçam o programa, desenvolvendo o interesse dos alunos, e que os profissionais e pesquisadores conheçam o Centro de Pesquisa, abrindo oportunidades para possíveis colaborações científicas.
RELATO DE EXPERIÊNCIA
Durante o período de férias de janeiro e fevereiro de 2019, participei do PEOp, estagiando no laboratório de biologia molecular do Centro de Pesquisa Boldrini. No laboratório, participei de um projeto que visa obter e analisar repertórios de anticorpos monoclonais contra alvos específicos, além de buscar novos biomarcadores para o desenvolvimento de ferramentas diagnósticas e possíveis anticorpos terapêuticos. Assim, participei de parte da rotina da técnica de hibridomas, como screening, caracterização, produção de anticorpos, e testes in vitro e in vivo. Dentre as técnicas aprendidas e realizadas, estão cultura de células, extração de RNA, síntese de cDNA, PCR, eletroforese de DNA, quantificação de proteínas, RNA e DNA, ELISA, citometria de fluxo, ensaio de viabilidade celular, e purificação de anticorpo.
A experiência no Centro de Pesquisa Boldrini permitiu-me conhecer melhor a rotina de um laboratório de pesquisa, onde diversos experimentos ocorrem simultaneamente. Assim, é necessária muita organização, pois vários equipamentos e materiais são compartilhados. Além disso, permitiu-me ver como a pesquisa pode por vezes ser incerta, pois muitas vezes os resultados diferem do esperado, sendo necessárias otimizações das técnicas, ou abrindo margem para novas descobertas. Dessa forma, dois fatores mostram-se limitantes na pesquisa: tempo e recursos financeiros. Na técnica de hibridomas, por exemplo, é utilizado muito material até a obtenção final dos anticorpos purificados, e também muito tempo, visto o número de etapas, algumas repetidas várias vezes.
CONCLUSÕES
Diante disso, o PEOp é uma grande oportunidade para os estudantes das áreas de saúde e biológicas conhecerem a rotina de um grande hospital, bem como desenvolver um interesse pela pesquisa científica. Além disso, permite o desenvolvimento de diversas habilidades profissionais, como comunicação, autonomia, trabalho em equipe, e raciocínio clínico e científico.
Graduação
Anticorpo monoclonal, imunoterapia, hibridomas, relato de experiência, Centro Infantil Boldrini