Avaliação da taxa de transcrito dos genes TRPC6 e PODXL, após overload de albumina em cultura celular de podócitos com e sem dano.
Genética
Introdução:
A proteinúria é um importante marcador de prognóstico para doença renal e geralmente reflete aumento na permeabilidade glomerular, principalmente para a albumina. 10-50% dos pacientes progridem para doença renal crônica (DRC), culminando em diálise e transplante. Um dos principais mecanismos que levam à proteinúria é o dano na barreira de filtração glomerular (BFG), constituída por três camadas: endotélio fenestrado, membrana basal glomerular e podócitos, células especializadas que recobrem a face urinária da BFG. Algumas moléculas importantes que participam da manutenção da barreira de filtração glomerular são a podocalixina e o canal de cálcio receptor potencial transitório C, codificados, respectivamente, pelos genes TRPC6 e PODXL. O gene TRPC6 codifica um receptor de potencial dos canais de cálcio que se localiza no complexo lipídico da membrana. Alguns mecanismos de como a desregulação do TRPC6 possa causar dano glomerular já foram propostos, apesar de ainda não completamente compreendidos: o aumento de íons Ca2+ parece modificar e interferir na modulação do citoesqueleto de actina dos pedicelos o que pode alterar a filtração exercida pelos podócitos. O gene PODXL codifica a podocalixina uma proteína importante no revestimento celular, situada na região do glicocálix responsável pela regulação da adesão e da morfologia dos podócitos e essencial para a manutenção dos diafragmas de fenda. Alguns estudos demonstram que o domínio citoplasmático da podocalixina está conectado ao citoesqueleto de actina sendo que em modelos animais com nefrose induzida pela droga puromicina aminoglicosídeo (PA) esta conexão da podocalixina com o citoesqueleto da actina é interrompida. Além do seu papel nos podócitos, a podocalixina é expressa em diversos tipos de tecidos e em muitos está associada a linhagens celulares malignas e neoplasias, inclusive em tecido renal.
Já se sabe que indivíduos com proteinúria apresentam lesão podocitária, as chamadas podocitopatias. No entanto existem controvérsias se a exposição prolongada dos podócitos a níveis elevados de albumina no ultrafiltrado destes indivíduos também poderiam atuar como coadjuvantes ou até mesmo desencadeando a lesão. Ainda, pouco se sabe quais são as consequências moleculares e seus mecanismos nos podócitos após a exposição ao excesso de albumina no filtrado glomerular.
Objetivo:
Avaliar se há diferença de expressão dos genes TRPC6 e PODXL, presentes nos pedicelos dos podócitos, frente a suplementação progressiva de albumina, em cultura de podócitos normais e em podócitos após indução de dano com exposição com droga PA.
Material e métodos:
Foi realizada cultura celular de podócitos condicionais imortalizados, diferenciados, passagens 17 a 22. A viabilidade celular após suplementação de albumina foi avaliada por time-course, tanto para exposição de albumina, por ensaios de MTT e calceína AM, como para exposição à droga PA, por imunocitoquímica indireta e marcação com faloidina.
Para exposição à albumina foram divididos dois grupos com relação ao tratamento com a droga PA; 1) sem tratamento; 2) com tratamento (15µg/ml por 12h). Posteriormente os podócitos foram expostos a diferentes concentrações de albumina (0;3;6;9,12,15,18,20,30 e 40 mg/ml) durante 24h. Após extração do RNA total com trizol e síntese de cDNA por RT–PCR, foi realizada a avaliação da taxa de transcrito dos genes TRPC6 e PODXL por Real-Time PCRq, utilizando o gene RPLP0 como controle endógeno. A diferença de expressão também foi verificada por imunocitoquímica indireta (ICI), pela intensidade de marcação das proteínas canal de cálcio receptor potencial transitório C e podocalixina. Os resultados foram obtidos empregando teste ANOVA e teste a posteriori de Turkey com p≤ 0,05. Todas as análises estatísticas foram realizadas com o programa SPSS.
Resultados:
A avaliação do TRPC6 mostrou resultados opostos entre os grupos de estudo 1 e 2. As células sem dano apresentaram, em todas as condições, redução de expressão de RNA (p<0,0001). Já as células com dano, apresentaram aumento de expressão apenas na condição de 40 mg/ml, apresentando expressão onze vezes maior que o controle (p<0,0001).
Com relação a análise do gene PODXL, em ambos os grupos, com e sem dano, houve aumento de expressão. Nos podócitos sem dano, a expressão foi 25 vezes e 54 vezes maior que o controle nas concentrações de 30 e 40 mg/ml de albumina, respectivamente (p<0,05); já nos podócitos com dano, a expressão foi 49, 55, 57, 65 e 68 vezes maior que o controle já na concentração de 15 mg/ml (p<0,05). Na análise de ICI ambas as proteínas apresentaram mesmo padrão de alteração de expressão encontrado por Real-Time.
Conclusão:
Os resultados deste estudo in vitro demonstraram que o insulto de suplementação de albumina nos podócitos com e sem dano, alterou a expressão dos genes TRPC6 e PODXL. Sendo, portanto, um passo inicial para melhor compreensão dos mecanismos moleculares relacionados a lesão podocitária após exposição dos podócitos à albumina. Estes resultados reforçam a necessidade de futuros estudos in vivo, nas mesmas condições, para podermos estabelecer relações mais precisas com o que acontece nos podócitos expostos a altas concentrações de albumina no filtrado glomerular em indivíduos com podocitopatias.
Doutorado
proteinúria; podócitos; puromicina aminoglicosídeo, albumina