Validação de meios de cultura para identificação e diferenciação de espécies do Complexo Cryptopcoccus neoformans/gattii com vistas à produção industrial
Ciências Básicas
Resumo
Espécies do gênero Cryptococcus são importantes agentes causais da criptococose, relevante problema de saúde pública no Brasil, em razão das altas taxas de infecção em indivíduos imunocomprometidos sendo a principal causa de morte dentre infecções fúngicas em pacientes com AIDS. Duas são as principais espécies causadoras da doença: Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii. C. neoformans acomete geralmente imunossuprimidos enquanto C. gattii é mais frequentemente isolado em indivíduos aparentemente imunocompetentes e, mesmo assim, causando infecção mais severa. Dessa forma, a identificação e diferenciação entre as duas espécies é de extrema importância para instauração de terapêutica correta. Ambas as espécies produzem melanina em meios específicos, como Ágar Níger, e a diferenciação entre elas pode ser realizada pelos laboratórios utilizando-se o meio de cultura Ágar L-canavanina-glicina-azul de bromotimol (CGB). Dentre os métodos automatizados, atualmente, apenas a espectrometria de massas identifica inequivocamente as duas espécies, assim como sequenciamento de DNA. Muitos centros de diagnóstico não contam com estas metodologias e não têm a possibilidade de preparar CGB, operação trabalhosa, detalhada e cara. A possibilidade de obtenção do meio CGB pronto no mercado traria benefícios para muitos centros de diagnóstico, que poderiam adquiri-los na medida de suas necessidades.
Objetivo
Desenvolver o processo e validar a produção industrial dos clássicos meios de cultura Ágar CGB e Ágar Niger, para fins diagnósticos de identificação e diferenciação de isolados clínicos das espécies C. neoformans e C. gattii.
Materiais e Métodos
Ágar CGB e Ágar Niger foram elaborados com apoio da área de desenvolvimento da empresa LaborClin-LTDA. Os testes laboratoriais foram realizados no Laboratório de Investigação em fungos-LIF do Departamento de Patologia Clínica (FCM- UNICAMP) com cepas ATCC e outras da Micoteca do LIF-FCM, todas previamente genotipadas e identificadas. Após crescimento satisfatório em ágar Sabouraud, os fungos foram repicados para os meios CGB e Niger e incubados à temperatura ambiente por até 5 dias. A identificação das espécies foi feita por observação de coloração diferenciada. No Ágar Niger, o crescimento de colônias de coloração marrom escura indica a presença de C. neoformans ou C. gattii, sendo que outras espécies e gêneros não apresentam esse crescimento. No Ágar CGB, a mudança da cor verde original do meio para azul cobalto indica resultado positivo, portanto, a identificação de C. gattii e a manutenção da cor verde original ou mudança para cor diferente do tom azul cobalto indica resultado negativo e a confirmação da espécie C. neoformans. Em adição, verificou-se a possibilidade de se cultivar a amostra inicialmente em Ágar Niger para a prova de gênero, para, posteriormente, ser repicada do Ágar Niger para o CGB para a prova de espécie. Os testes foram repetidos mensalmente até completar 6 meses de armazenamento para avaliação de reprodutibilidade e determinação do prazo de validade do produto.
Resultados
Ao todo, 30 cepas foram utilizadas para validar os meios de cultura Ágar Niger e CGB. Destas, 9 C. gattii (8 isolados clínicos e 1 ATCC), 10 C. neoformans (9 isolados clínicos, sendo 1 C. neoformans var. grubii e 1 ATCC), e 11 outras espécies, incluindo 3 C. laurentii, 2 C. albidus, 1 C. humicola, 1 Candida parapsilosis, 1 Candida krusei, 1 Candida albicans, 1 Candida auris e 1 Trichosporon mucoides.
No Ágar Niger, obteve-se o esperado, de acordo com a literatura: todas as 19 cepas de C. neoformans e C. gattii apresentaram resultado positivo, com o crescimento de colônias marrons. Todas as outras 11 espécies mostraram resultado negativo.
Por sua vez, no Ágar CGB, esperava-se que apenas C. gattii apresentasse resultado positivo e os isolados de C. neoformans e os outros gêneros e espécies, resultado negativo. No entanto, de 9 cepas de C. gattii, apenas 7 apresentaram resultado positivo, enquanto apenas 6 das 9 cepas de C. neoformans resultado negativo. Repetiu-se o teste com CGB para as cepas com resultado anterior incondizente com o esperado, mas desta vez utilizando colônias previamente crescidas em Ágar Niger, para também testar a eficiência em realizar esse procedimento. Deste modo, todas as cepas geraram no CGB o resultado esperado. Quanto aos outros gêneros e espécies avaliados, todas as cepas de C. laurentii, C. humicola, Candida parapsilosis, Candida albicans mostraram resultado positivo no CGB. No entanto, é importante ressaltar que no teste com Ágar Niger estes tiveram resultado negativo e dessa forma, por associação e interpretação dos resultados, seriam descartados como hipótese de pertencerem ao complexo Cryptococcus neoformans/gattii.
O limite de tempo para manutenção da qualidade reprodutibilidade e dos testes foi de 6 meses após a fabricação dos meios de cultura, limitando então também a este tempo o prazo de validade dos produtos. Nenhum dos isolados mostrou crescimento em Ágar Niger após 6 meses. No meio CGB, a cepa ATCC de C. gattii mostrou resultado positivo, mesmo após 6 meses, com o mesmo desempenho esperado para o meio dentro do prazo de validade e os isolados clínicos também tiveram resultado positivo, no entanto, a coloração do meio obtida foi visivelmente mais clara que a ideal.
Conclusões
Os meios de cultura produzidos industrialmente mostraram bom desempenho, com resultados de acordo com o esperado para os microrganismos avaliados. A realização sequencial dos testes em Ágar Niger seguido de CGB é uma boa opção para a obtenção de um diagnóstico laboratorial confiável, eliminando possíveis resultados falsos positivos ou negativos, associados a outros gêneros e espécies que podem causar essa confusão. É importante salientar que a associação com exames clínicos e de imagem é sempre necessária para a conclusão de um diagnóstico.
O prazo de validade observado (6 meses) é bastante viável e muito comum em outros insumos utilizados na rotina diagnóstica.
A realização dos testes com esses meios de cultura é uma alternativa adequada e acessível para centros de diagnóstico que não possuem a infraestrutura para utilizar métodos mais sofisticados e onerosos.
Graduação
Criptococose; Cryptococcus; Diagnóstico laboratorial; Micologia