Qualificações e Defesas - Detalhes

Candidato(a): Maria Luísa Boldim Vaggione
Orientador(a): Kleber Gomes Franchini

Os fatores de transcrição MEF2 (Myocyte Enhancer Factor 2) foram descritos inicialmente como proteínas que se ligam a sequências de DNA ricas em A/T nos promotores de vários genes músculo-específicos. O fator MEF2C, em especial, se diferencia dos demais membros da família devido à presença de um fragmento denominado ‘g’ (gama) no último exon, o qual pode ser incluído ou excluído no processamento alternativo do mRNA precursor. Sua presença está relacionada com função repressora do fator de transcrição MEF2C. A desregulação do fator MEF2C correlaciona-se com o desenvolvimento de insuficiência cardíaca, porém os mecanismos responsáveis não são conhecidos. No presente estudo investigamos os fatores potencialmente envolvidos na inclusão do fragmento g durante o processo de splicing alternativo. Por meio da indução de diferenciação de células H9c2 para um fenótipo cardíaco quantificamos de forma absoluta os transcritos Mef2cγ+ e Mef2cg- durante a diferenciação celular e observamos predominância da isoforma que não inclui o domínio g em todos os períodos avaliados, assim como aumento na razão g-/g+. Camundongos transgênicos que superexpressam a isoforma que contém o domínio gama desenvolveram insuficiência cardíaca de forma espontânea, acompanhado pelo aumento na expressão de genes marcadores de proliferação celular e diminuição em transcritos de genes associados ao metabolismo energético e organização celular. Em camundongos submetidos à sobrecarga pressórica foi detectado aumento na quantidade de Mef2cg+, e o mesmo padrão de alteração gênica dos animais transgênicos. Por meio de avaliação in silico das sequências de nucleotídeos que flanqueiam o domínio gama, elencamos fatores potencialmente envolvidos na regulação do splicing alternativo dessa região, sendo eles: RbFox1, RbFox2, Celf1, Celf2. Utilizando ensaios com minigene que promove a transcrição da região sujeita ao splicing em células de mamífero, observamos que o fator Rbfox1 foi capaz de alterar de forma significativa a quantificação relativa dos transcritos de Mef2cg+ e Mef2cg-, propiciando aumento na inclusão do domínio gama. Mutações sítio-dirigidas nos motivos de reconhecimento de RbFox1 mais próximos localizados upstream e downstream à região gama não foram capazes de alterar esse resultado. O fator Rbfox2 promove tendência de diminuição na inclusão da região gama e aumento significativo em transcritos de Mef2cg-. Com relação aos fatores de splicing Celf investigados neste estudo, Celf2 aparenta não ter efeito sobre o splicing alternativo da região gama. Em conjunto, os resultados obtidos neste projeto fortalecem a hipótese de que a inclusão de g em Mef2c esta associada aos efeitos deletérios observados em cardiomiócitos durante a patofisiologia da insuficiência cardíaca e indicam potenciais protagonistas da regulação do splicing alternativo desse domínio transrepressor.