Foram feitas coletas sistemáticas de amostras em mulheres que apresentaram sintomas da doença durante a gravidez; de 17 casos investigados, 14 deram positivo
Pesquisa em placentas de mulheres que tiveram filho no Caism (Centro de Atenção Integral à Saúde da Mulher) da Unicamp identificou 14 casos positivos para Zika vírus, dentre 17 analisados, evidenciando que a placenta é um importante reservatório para o vírus na infecção. Foram acompanhadas gestantes que apresentaram sintomas da doença – febre e manchas na pele (lesões exantemáticas febris) – durante a gravidez ou com fetos com microcefalia, nos anos de 2016 e 2017. A análise do tecido foi feita após coleta sistemática seguindo protocolo do Biobanco da instituição. No entanto, o exame realizado no laboratório de referência, utilizando o protocolo recomendado pelo Ministério da Saúde, foi negativo em todos esses casos. Do total de 77 mulheres identificadas com sintomas, 49 tiveram o parto no Caism. Houve dois casos de microcefalia, ambos evoluindo para óbito neonatal.
“Foi um resultado surpreendente, que traz a necessidade de buscar as mães cujos exames de placenta deram positivo, e essas crianças, para realizar uma avaliação completa e observar se não surgiram complicações relacionadas ao Zika vírus não identificadas na época do parto, apesar da rigorosa avaliação e acompanhamento que eram então preconizados”, afirma a professora Eliana Amaral, da Faculdade de Ciências Médicas (FCM), que orientou o estudo financiado por Fapesp e CNPq. “A microcefalia é o ápice em termos de gravidade, mas podem ocorrer outras complicações – neurológica, ocular ou auditiva. Após os partos, deixamos agendados retornos para acompanhamento por especialistas, mas com a ausência de problemas aparentes, poucas mães voltaram com os seus filhos.”
Outro motivo deste baixo retorno seria a despreocupação das mães diante dos resultados negativos da sorologia (sangue) e do exame na urina, que foram colhidos quando manifestaram sintomas da doença na gravidez – o que pode acontecer pela pouca duração dos exames positivos nessa infecção – mas esse comportamento deve mudar ao saberem do resultado positivo no exame da placenta. “A placenta é sempre um órgão a estudar em casos de infecção e, no caso de zika, mostrou ser um marcador de que a mãe teve a doença, que o vírus, pelo menos, chegou até lá, podendo ter infectado a criança ou ser uma barreira”, atesta a professora de obstetrícia da Faculdade de Ciências Médicas (FCM).
Os exames de laboratório foram realizados por Emanuella Meneses Venceslau em sua tese de doutorado, que teve coorientação da docente Maria Laura Costa do Nascimento, da FCM, e a colaboração de José Luiz Proença Módena, coordenador do Laboratório de Vírus Emergentes do Instituto de Biologia (LEVE-IB). “O protocolo do Biobanco recomenda coleta sistemática, em várias regiões da placenta (placa coriônica, vilosidade coriônica, placa basal), de forma a garantir adequada representatividade, além da membrana amniótica e do cordão umbilical. As 14 placentas foram positivas pelo kit de RT-qPCR para ZIKV utilizado no nosso laboratório de pesquisa, em comparação com nenhuma das amostras procedentes de uma coleta simples por placenta e analisadas no laboratório de referência, com outro kit”, explica a autora da tese. “A utilização do mesmo kit preconizado pelo laboratório padrão foi capaz de identificar 10 dos 14 casos positivos pelo kit da pesquisa. Ou seja, provavelmente, a maior diferença está relacionada ao padrão de coleta, armazenamento e transporte das amostras”.
Emanuella Venceslau lembra que o surto de zika que ocorreu entre abril de 2015 e novembro de 2016 é considerado o maior desse tipo de vírus da história. “Depois que houve esse pico no Brasil, ela se espalhou para outros países da América do Sul, América Central e Caribe. Apesar da queda no número de casos, a infecção pelo vírus da zika continua sendo uma preocupação para as grávidas, como afirma o infectologista Artur Timermann, presidente da Sociedade Brasileira de Arborivores [doenças transmitidas por insetos].”
Agilidade do governo
Na opinião de Eliana Amaral, no início da epidemia no Brasil, o governo procurou dar as respostas mais rápidas possíveis à época, estabelecendo um protocolo para exames e criando a infraestrutura para transporte e análise de amostras – o laboratório de referência no estado de São Paulo é o Instituto Adolfo Lutz. “A Unicamp, por sua vez, preocupou-se imediatamente com a transmissão vertical da doença (da gestante para a criança) e criou um grupo de pesquisa colaborativo liderado inicialmente pelo IB, mas envolvendo as unidades de saúde, Caism e Hospital das Clínicas. Era o momento, também, em que o Caism criava seu Biobanco de placenta, guardando amostras mediante autorização, para poder aprofundar estudos com várias doenças, incluindo as infecções e outras que podem afetar a gestante e seus filhos.”
A orientadora da pesquisa atribui à professora Maria Laura Costa a proposta de adotar um protocolo que recomenda obter amostras de diferentes lugares da placenta, com base em experiência que teve em seu pós-doutoramento na Washington University, em Saint Louis (EUA). “Essa é a primeira pesquisa que demonstra a necessidade de mudar a forma de coleta e de adotar o kit de testes que mostrou maior positividade do vírus da zika.”
Maria Laura Costa ressalta a grande importância da placenta para o diagnóstico, que é difícil de definir na fase aguda da doença. “Muitas pacientes são assintomáticas, outras têm sintomas leves e há aquelas que demoram a procurar o serviço de saúde. E a janela de oportunidade para que um exame dê positivo, na infecção aguda, é pequena: de até cinco dias para sangue e até oito dias para urina. Já a placenta é um órgão onde a positividade permanece por meses e meses depois da infecção.”
O pesquisador José Módena acrescenta que 70% dos infectados com Zika vírus são assintomáticos e que, mesmo focando os outros 30%, a sintomatologia é ampla e leve, fazendo com que o doente demore a procurar atendimento. “Por vezes, quando ele procura, a janela de oportunidade de diagnóstico já expirou. Uma alternativa para várias doenças infecciosas é procurar o anticorpo, para saber se a pessoa já entrou em contato com aquele patógeno. Existem kits comerciais para análise sorológica, mas estamos em um país que possui muitos vírus parecidos com zika, como dengue e febre amarela. Há uma reatividade cruzada muito grande, tornando difícil o diagnóstico pós-fase aguda.”
Para Módena, o grupo da Unicamp criou a oportunidade de se obter uma amostra de placenta diferenciada, colhida de maneira estratificada, sistematizada e com acompanhamento desde a coleta até a estocagem. “No estudo, tinha-se todo o controle de qualidade e temperatura, podendo-se avaliar a detecção de vírus na placenta como um indício para realizar um diagnóstico apurado em mães que apresentaram sintomas em algum momento da gestação ou que tiveram alguma complicação fetal sugestiva de zika congênita, da mãe para o filho. Outra característica da infecção por Zika vírus é que, se a gestante entra em contato com o agente, nem sempre produz anticorpo, o que torna o diagnóstico ainda mais desafiador.”
Coleta e armazenamento
Maria Laura Costa explica que a preservação de placentas não é um procedimento padrão e que normalmente elas são descartadas. “É muito difícil trabalhar com amostras colhidas no momento do parto, porque na maioria das vezes não é agendado e realizado por equipe de plantão. Se a placenta é um órgão que pesa em média 400 gramas, é importante refletir sobre o quanto apenas uma amostra pode ser representativa. Por isso, o treinamento da equipe é fundamental para garantir a representatividade e a qualidade das amostras. A coleta da amostra deve ser o mais precoce possível, com tempo limite de até 12 horas. Em nosso estudo, a coleta se deu em prazo bastante curto, até duas horas depois do parto. Colhemos amostras de quatro regiões diferentes da placenta, para ter representatividade, e colocamos o tecido imediatamente em nitrogênio líquido (a menos 80ºC), o que garante a qualidade para o momento do exame.”
José Módena informa que, pelo protocolo oficial padronizado, não há obrigatoriedade de enviar a amostra em baixa temperatura para o laboratório de referência, que é centralizado em São Paulo. “Coloca-se como recomendado, mas boa parte dos centros não tem como cumprir essas condições de transporte. O protocolo descreve apenas que a amostrar deve medir 1 centímetro por 1 centímetro, sem especificar uma região da placenta, nem o tempo ou qualidade do transporte e armazenamento.”
A professora Eliana Amaral ressalta a necessidade, agora, de conversar com as autoridades da saúde para sugerir que a padronização seja mudada. “O protocolo oficial vigente em todo o país certamente não enfocava esses detalhes técnicos, até porque não havia resultados de pesquisa para mostrar que deveria ser assim. Há também a questão dos kits utilizados, já que o nosso foi diferente do adotado, na época, pelo laboratório de referência. O canal com as autoridades está sempre porque a Unicamp é referência no cuidado de gestantes. Já realizamos diversos estudos que levaram a mudanças de conduta no estado de São Paulo, por exemplo, quando houve a vacinação contra febre amarela ou rubéola em massa e gestantes foram vacinadas inadvertidamente. Mostramos que nada ocorreu, que a vacina foi segura. Já somos reconhecidos por essa expertise, sendo esse o nosso papel: fazer pesquisas que possam melhorar o cuidado à saúde das pessoas.”
Os pesquisadores da Unicamp reforçam que a intenção é colaborar com as instâncias que definem as políticas de saúde, enaltecendo a rapidez que pesquisadores e governo, juntos, buscaram organizar o atendimento inicial às vítimas da epidemia por Zika vírus. Mas salientam que o aprimoramento dos protocolos baseado em novas pesquisas é uma rotina de colaboração entre a Universidade e órgãos de saúde, em especial nos temas de infecções na gestação, desde o final da década de 80. “A questão, aqui, é salientar a diferença de resultados na detecção do vírus. Não se trata de identificar um problema de qualidade, porque talvez a amostra colhida segundo as recomendações então previstas não permitisse mesmo a detecção”, observa José Módena.
Maria Laura Costa alerta que, além do Zika vírus, outros vírus emergentes são ameaças constantes. “Eles estão aí e a qualquer momento podemos ter uma nova epidemia, de um novo vírus, e devemos estar preparados para uma resposta rápida. Sobre zika, os estudos de acompanhamento de longo prazo estão começando; ninguém sabe ao certo como seria a evolução dos bebês nascidos sem malformação grave, mas de mães cujo exame de placenta deu positivo. Eles são muito jovens e ainda precisamos definir se têm sequelas ou não. A nova fase desse estudo, reavaliando essas crianças, vai ajudar a encontrar algumas das respostas às perguntas que ficaram”.
Casos de infecção provável por zika (Brasil, 2019)
