As micobactérias, incluindo o complexo Mycobacterium tuberculosis (CMTB) e as micobactérias não tuberculosas (MNT), são agentes de grande relevância clínica e epidemiológica. A tuberculose segue entre as principais causas de morbimortalidade mundial, enquanto as infecções por MNT vêm aumentando, sobretudo em populações imunocomprometidas. Nessa conjuntura, a precisão e a rapidez do diagnóstico laboratorial são essenciais para o manejo clínico e para estratégias de saúde pública. O objetivo desta tese foi analisar a evolução das metodologias diagnósticas aplicadas às micobactérias em um hospital universitário de médio porte ao longo de duas décadas, comparando técnicas manuais, moleculares e espectrométricas, com foco em aplicabilidade, custo benefício e impacto na rotina laboratorial. Trata-se de um estudo descritivo, retrospectivo e comparativo realizado no Setor de Micobactérias do Hospital de Clínicas da UNICAMP, com análise de amostras processadas por baciloscopia, cultura, PNB, PCR multiplex, PRA-PCR, GeneXpert®, GenoType®, MTBDRplus® e MALDI-TOF. Os resultados mostraram que a combinação da PCR multiplex com o PRA-PCR apresentou alto desempenho na diferenciação entre CMTB e MNT, com baixo custo operacional. A MALDI-TOF destacou-se pela rapidez (identificação em minutos), elevada reprodutibilidade e pela acurácia superior a 95 na identificação de MNT, sendo especialmente útil em rotinas hospitalares. Por sua vez, os testes moleculares GeneXpert® e Genotype® confirmaram-se essenciais na detecção rápida de resistência à rifampicina e isoniazida, favorecendo a escolha terapêutica adequada. Conclui-se que a integração de métodos manuais, moleculares e espectrométricos constitui a estratégia mais eficiente para laboratórios hospitalares de médio porte, equilibrando custo, tempo de resposta e acurácia diagnóstica. Essa abordagem fortalece a vigilância epidemiológica, acelera diagnósticos, orienta terapias individualizadas e contribui para políticas públicas mais eficazes no enfrentamento das micobacterioses.
