Efeito cardíaco da 6-nitrodopamina em ratos: questionando um dogma da fisiologia do coração

RESUMO

INTRODUÇÃO: A 6-nitrodopamina (6-ND) é um mediador endógeno do Sistema Cardiovascular produzido a partir da nitração da dopamina (1). Em ratos, a liberação endógena de 6-ND foi detectada por Cromatografia Líquida Acoplada à Espectrometria de Massas (LC-MS/MS) em ductos deferentes. No qual exerce um potente efeito contrátil que é inibido por antagonistas de receptores adrenérgicos α1, β1 e β1/β2 (2, 9). No coração, os receptores β1-adrenérgicos predominam, correspondendo por aproximadamente 80% dos receptores-β (3-5). A ativação do receptor β1-adrenérgico é a responsável pelo controle da frequência cardíaca e da contratilidade ventricular (efeito cronotrópico e inotrópico positivo) (3-5). O dogma atual é de que ativação desses receptores é causada principalmente pela liberação de noradrenalina liberada por terminais nervosos adrenérgicos (3-5). Uma vez que antagonistas-β1 bloqueiam a ação da 6-ND no ducto deferente, investigamos se a 6-ND é liberada pelo coração de ratos e seu efeito cronotrópico em átrios isolados e em animais anestesiados.

OBJETIVOS: Avaliar a liberação endógena de 6-ND pelo átrio direto e ventrículos isolados de ratos e caracterizar seu efeito cronotrópico nesses tecidos.

MÉTODOS: 1. Animais: Ratos Wistar machos adultos fornecidos pelo CEMIB e por Animais de Laboratório Criação e Com. (Campinas, Brasil). Os protocolos experimentais foram aprovados pelo CEUA da UNICAMP (Protocolos nº 5746-1/2021; 5831-1/2021) (6). 2. Mensuração da liberação basal de catecolaminas em átrios e ventrículos por LC-MS/MS: Os átrios diretos e ventrículos isolados foram suspensos separadamente em um banho de órgãos contendo 5 mL de solução de Krebs-Henseilet (KHS) e ácido ascórbico (3 mM) continuamente gaseificado (95% O2 / 5% CO2) a 37 ºC por 20 min, na ausência e na presença de L-NAME (100 μM) ou tetrodotoxina (TTX; 1 μM). Duas alíquotas de 2 mL do sobrenadante foram e armazenados a -20° C (7). As concentrações de 6-ND, dopamina, noradrenalina e adrenalina foram mensuradas por LC-MS/MS (8). 3. Análise da frequência de átrios direitos isolados: Após o período de equilíbrio, em banhos de órgãos separados, a frequência atrial foi monitorada por 30 minutos em diferentes concentrações de 6-ND (0,1, 1, 10 e 100 pM), dopamina (0,1, 1, 10 e 100 nM), noradrenalina (1, 10, 100 e 1000 pM) ou adrenalina (1, 10, 100 e 1000 pM). Em processo análogo, a frequência atrial também foi monitorada por 30 minutos na presença de L-NAME (100 μM), D-NAME (100 μM), ODQ (100 μM), TTX (1 μM) e atropina (100 nM). Em seguida, foram adicionados antagonistas β1-adrenérgicos (0,1 e 1 μM) atenolol, betaxolol e metoprolol. 4. Medida da pressão arterial (PA) e frequência cardíaca (FC) in vivo: Os animais foram anestesiados com tiopental sódico (40 mg/kg, ip). Para monitoramento contínuo da PA, na carótida comum esquerda, foi conectado um cateter ao transdutor de pressão. A FC foi calculada pela derivada da pressão de pulso. Após 30 minutos de registros, cada animal recebeu 1 pmol/kg de 6-ND, noradrenalina, adrenalina ou dopamina em bolus intravenoso(1 mL/kg) e sua PAM e FC foram monitoradas por 60 minutos.

RESULTADOS: Liberação de 6-ND, dopamina, noradrenalina e adrenalina Os átrios direitos e ventrículos apresentaram liberação basal de 6-ND, detectada por LC-MS/MS, reduzida significativamente (p < 0.05) na presença do inibidor da óxido nítrico-sintase L-NAME (20 min; 100 μM), mas não foi afetada por TTX. A dopamina foi detectada em 15/36 amostras (1,21 ± 0,47 ng/mL) e noradrenalina em 11/36 amostras (0,27 ± 0,05 ng/mL) de átrio direito e em nenhum de ventrículos. Os níveis de adrenalina estavam abaixo do limiar de detecção (0,1 ng/mL) em todas as amostras. Efeitos cronotrópicos da 6-ND A 6-ND (1pM) aumentou significativamente a frequência atrial, sendo 100 vezes mais potente que a noradrenalina e a adrenalina. Os antagonistas-β1 seletivos (atenolol, betaxolol e metroprolol; 0,1 e 1 μM) somente reduziram a frequência em concentrações que impediram o aumento da frequência atrial induzido pela 6–ND (1 pM). Por outro lado, o bloqueio β1, não afetou o efeito da dopamina (10 nM), noradrenalina (100 pM) ou adrenalina (100 pM). Em animais tratados cronicamente com L-NAME e em átrios pré-tratados com L-NAME não houve redução da frequência. A TTX não impediu a redução da frequência atrial induzida por L-NAME ou por preparações tratadas com β1-bloqueadores. Em ratos anestesiados, 1 pmol/kg, apenas a 6-ND causou um aumento significativo na frequência cardíaca. In vivo, a 6-ND demonstrou ter efeito cronotrópico positivo cerca de 100 vezes mais potente que a noradrenalina. O aumento de FC induzido pela 6-ND persistiu após pelo menos 60 minutos. Para as demais catecolaminas a FC basal retornou após 30 minutos.

CONCLUSÃO: A 6-ND é liberada pelo átrio e ventrículos de rato e sua síntese é inibida por L-NAME, reduzindo a frequência atrial e a cardíaca. A 6-ND induz um efeito cronotrópico positivo 100 vezes mais potente que a noradrenalina e adrenalina. Os resultados demonstram que em ratos o efeito cronotrópico negativo dos β1-bloqueadores ocorre devido ao bloqueio seletivo do receptor específico para 6-ND (9), indicando que o cronotropismo cardíaco é modulado pela liberação basal desse mediador endógeno não neurogênico.

BIBLIOGRAFIA: 1. M. d’Ischia, C. Costantini, Nitric oxide-induced nitration of catecholamines neurotransmitters: a key to neuronal degeneration? Bioorg. Med. Chem. 3 (7) (1995) 923–927, https://doi.org/10.1016/0968-0896(95)00083-s (7582969). 2. A.T. Lima, A.C. Amorim, J. Britto-Júnior, R.R. Campitelli, A. Fregonesi A, F.Z. Mónica, E. Antunes, G. De Nucci. b1- and b1b2-adrenergic receptor antagonists block 6-nitrodopamine contractions on the rat isolated epididymal vas deferens. Eur J Pharmacol. (2022), Submitted. 3. G.L. Stiles, S. Taylor, R.J. Lefkowitz. Human cardiac beta-adrenergic receptors: subtype heterogeneity delineated by direct radioligand binding. Life Sci. 33 (1983), 467-73. https://doi.org/10.1016/0024-3205(83)90796-8. 4. M.R. Bristow, R. Ginsburg, V. Umans, M. Fowler, W. Minobe, R. Rasmussen, P. Zera, R. Menlove, P. Shah, S. Jamieson, et al. Beta 1- and beta 2-adrenergic-receptor subpopulations in nonfailing and failing human ventricular myocardium: coupling of both receptor subtypes to muscle contraction and selective beta 1-receptor down-regulation in heart failure. Circ Res. 59 (1986), 297-309. https://doi.org/ 10.1161/01.res.59.3.297. 5. R.J. Lefkowitz, H.A. Rockman, W.J. Koch. Catecholamines, cardiac beta- adrenergic receptors, and heart failure. Circulation. 11 (2000), 101(14):1634-7. https://doi.org/10.1161/01.cir.101.14.1634.1 6. N. Percie du Sert, V. Hurst, A. Ahluwalia, S. Alam, M.T. Avey, M. Baker, W.J. Browne, A. Clark, I.C. Cuthill, U. Dirnagl, M. Emerson, P. Garner, S.T. Holgate, D.W. Howells, N.A Karp, S.E. Lazic, K. Lidster, C.J. MacCallum, M. Macleod, E.J Pearl, O.H. Petersen, F. Rawle, P. Reynolds, K. Rooney, E.S. Sena, S.D. Silberberg, T. Steckler, H. Würbel. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 14 (2020) 18(7):e3000410. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000410. 7. J. Britto-Júnior, N.J. Antunes, R. Campos, M. Sucupira, G.D. Mendes, F. Fernandes, M.O. Moraes, M.E.A. Moraes, G. De Nucci. Determination of dopamine, noradrenaline, and adrenaline in Krebs-Henseleit solution by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry and measurement of their basal release from Chelonoidis carbonaria aortae in vitro. Biomed Chromatogr. 35 (2021), e4978. https://doi.org/ 10.1002/bmc.4978. 8. R. Campos, D.H.A. Pinheiro, J. Britto-Júnior, H.A Castro, G.D. Mendes, M.O. Moraes, M.E.A. Moraes, R.A.B Lopes-Martins, N.J. Antunes, G. De Nucci. Quantification of 6-nitrodopamine in Krebs-Henseleit`s solution by LC-MS-MS for the assessment of its basal release from Chelonoidis carbonaria aortae in vitro. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 22 (2021), 1173:122668. https://doi.org/ 10.1016/j.jchromb.2021.122668. 9. Britto-Júnior J, Ximenes L, Ribeiro A, Fregonesi A, Campos R, Ricardo de Almeida Kiguti L, Mónica FZ, Antunes E, De Nucci G. 6-Nitrodopamine is an endogenous mediator of rat isolated epididymal vas deferens contractions induced by electric-field stimulation. Eur J Pharmacol. 2021 Nov 15;911:174544. doi: 10.1016/j.ejphar.2021.174544. Epub 2021 Oct 1. PMID: 34606837.

PALAVRA-CHAVE: 6-nitrodopamine; 6-nitrodopamina; coração; heart; cronotropismo; chronotropism; rats; beta adrenergic; catecolaminas; cathecolamines; heart rate; atrial rate;