Qualificações e Defesas

Resumo

A proteinúria é caracterizada pela excreção urinária aumentada de proteína, podendo ser um quadro persistente, mesmo em quantidade bastante reduzida, mas que quando acima do limite considerado normal constitui um importante indicativo de doença glomerular primária ou secundária e de desenvolvimento de doença renal crônica (DRC), além de servir como um importante marcador prognóstico para esta condição. Os podócitos são células altamente especializadas e diferenciadas que recobrem os capilares glomerulares na face externa (urinária) da membrana basal glomerular e são compostos por três segmentos morfológica e funcionalmente diferentes: um corpo celular, processos principais e pedicelos, que são longas projeções citoplasmáticas. Danos em qualquer um dos três domínios dos pedicelos alteram os feixes contráteis de actina, normalmente paralelos, promovendo reorganização ativa desses filamentos, perda do padrão normal de interdigitações causando o apagamento dos pedicelos e a consequente perda de proteína pela urina (proteinúria). Já se sabe que a lesão dos podócitos leva a albuminúria progressiva, no entanto, existem controvérsias em relação ao impacto da proteinúria para o agravamento do apagamento nas podocitopatias. Existem poucos estudos sobre as consequências moleculares resultantes da exposição prolongada ao overload de albumina em podócitos humanos in vitro. Em projeto anterior, durante o mestrado da aluna, foram realizados experimentos de exposição ao overload progressivo de albumina (0, 3, 9, 12, 20 e 40 mg/mL) em cultura celular de podócitos humanos sem e com dano prévio induzido com puromicina aminoglicosídeo (PAN), e posterior avaliação da expressão dos genes PODXL e TRPC6. O objetivo do presente trabalho foi identificar alterações de expressão dos genes PODXL e TRPC6 após retirada do overload de albumina em cultura celular de podócitos com e sem dano prévio, nas seguintes condições: 1) para o gene PODXL, na concentração de 40 mg/mL sem dano prévio, e nas concentrações de 20 e 40 mg/mL com dano prévio, sendo acondição de 0 mg/mL como controle. 2) No caso do gene TRPC6, nas concentrações de 3, 20 e 40 mg/mL sem dano prévio, e nas concentrações de 20 e 40 mg/mL com dano prévio. A condição de 0 mg/mL como controle. A retirada foi realizada de forma gradual e abrupta, com avaliação de expressão relativa por PCR quantitativo real-time e expressão das proteínas por Western Blot. Como na literatura há associação de alteração de expressão do gene PODXL com tumorigênese, seja no processo de malignização celular, como no potencial metastático, em diversos tecidos humanos, foi avaliado o potencial tumorigênico de alteração de expressão de PODXL frente às seguintes condições: overload de albumina a 40 mg/mL sem dano e overload de albumina 20 e 40 mg/mL com dano, sempre utilizando a condição de 0 mg/mL como controle. Para isso, foram empregados experimentos específicos de crescimento celular, ensaio de migração e ensaio clonogênico. Os resultados foram analisados com teste ANOVA e Tukey, com p≤0,05. Houve recuperação de fenótipo para o gene PODXL exclusivamente na condição de retirada gradual do overload de 20 mg/mLtanto a nível de RNA (p = 0,631004) quanto a nível de proteína (p=0,2378032243) em podócitos previamente expostos a PAN. Nas outras condições ainda permaneceu a diferença de expressão (p<0.01) com superexpressão. Para o gene TRPC6, houve recuperação de fenótipo em todas as condições, a nível de RNA e de proteína (p>0,05). Observou-se ainda, indicativos iniciais de possível associação entre aumento de proliferação celular nas condições de superexpressão de PODXL analisadas, sendo um passo inicial para uma possível relação causal entre a exposição excessiva de albumina nos podócitos, aumento de expressão de podocalixina e malignização de tecidos adjacentes.

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